用于轉(zhuǎn)染和單細胞培養(yǎng)的化學限定培養(yǎng)基

2015年第24屆歐洲動物細胞技術學會年會

題目：用于轉(zhuǎn)染和單細胞培養(yǎng)的化學限定培養(yǎng)基

BMC Proceedings20159 (Suppl 9) :P27

https://doi.org/10.1186/1753-6561-9-S9-P27

背景

先進的培養(yǎng)基和補料開發(fā)已經(jīng)多次證明了其提高生物工藝效率的潛力。通過應用這種先進的化學限定和無動物成分配方，結(jié)合最新的細胞系，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的產(chǎn)量被推進到每升2克。本文介紹了用于轉(zhuǎn)染和單細胞生長的專用培養(yǎng)基的設計進展。瞬時轉(zhuǎn)染在基礎科研、藥物原料生產(chǎn)、個體醫(yī)學和疫苗生產(chǎn)上都有應用。瞬時基因有效表達的規(guī)模升級，需要同時支持細胞生長和轉(zhuǎn)染的雙功能培養(yǎng)基。

材料與方法

在96孔板中觀察了化學限定的無動物源培養(yǎng)基對單細胞生長的影響，并與含血清培養(yǎng)基進行了比較。單細胞的生長通過Cellavista高通量細胞成像和分析工作站進行分析，并對不同的CHO細胞系進行了克隆選擇和規(guī)模升級（擴大到轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)）。亞克隆細胞表達的重組蛋白分離后用ELISA定量，并進行了活性測定。

對瞬時轉(zhuǎn)染，開發(fā)的培養(yǎng)基配方在CHO細胞和人細胞系上進行了測試。轉(zhuǎn)染效率用陽離子多聚體轉(zhuǎn)染試劑盒和GFP表達質(zhì)粒進行評估。對轉(zhuǎn)染后采用分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)和偽灌注培養(yǎng)的HEK細胞系表達IgG1抗體進行了調(diào)查，蛋白A聯(lián)合HPLC進行抗體定量。被陽離子試劑轉(zhuǎn)染的細胞密度通常為3×106細胞/ml，表達GFP或IgG1的質(zhì)粒為2pgDNA/細胞。轉(zhuǎn)染期間細胞培養(yǎng)體積為4ml~1000ml。

結(jié)果

結(jié)果顯示，不同的單細胞能成功的從96孔板擴增至24孔板，再到細胞培養(yǎng)瓶和轉(zhuǎn)瓶。采用有限稀釋法得到的細胞存在個體差異，所篩選的細胞克隆表現(xiàn)出不同的生長和表達性能。8個有代表性的細胞克隆最高密度為1.9×106/ml至8.5×106次方/ml，表達的蛋白產(chǎn)量和活性存在3倍的差異。無動物源細胞培養(yǎng)基對應的克隆效率仍高于含血清的培養(yǎng)基。

對于瞬時轉(zhuǎn)染，研發(fā)的HEK轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基支持穩(wěn)定的細胞生長，使分批培養(yǎng)的細胞保持高密度（最高為16X106 細胞/ml）和高存活率，在轉(zhuǎn)染時使用新鮮培養(yǎng)基，對于不同的HEK細胞系，轉(zhuǎn)染效率為68%-94%。對于一種待評估的CHO細胞系，效率達75%-92%（見圖1A）。成功的小規(guī)模偽灌注培養(yǎng)顯示該方法的可行性，并且可應用于生物反應器。對于不穩(wěn)定的產(chǎn)物如特異性的酶，該灌流過程令人關注。瞬時轉(zhuǎn)染用的一款商品化培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞表達的單克隆抗體滴度為90-150mg/L，而用研發(fā)的Xell培養(yǎng)基，可使單抗滴度升高至310-430mg/L,平均升高了3.1倍。在轉(zhuǎn)染后使用優(yōu)化的流程和合適的培養(yǎng)基，可使產(chǎn)量進一步升高至750 - 850 mg/L。和對照的培養(yǎng)基相比，升高了6.7倍（見圖1B）。

圖1. 轉(zhuǎn)染效率總覽。A. 使用開發(fā)的Xell培養(yǎng)基。盡管該培養(yǎng)基專為HEK細胞設計，但對另一種人細胞系和CHO-K1也支持高效轉(zhuǎn)染。B. 轉(zhuǎn)染基因表達的單克隆抗體量。Xell開發(fā)的培養(yǎng)基和一款商品化培養(yǎng)基進行了比較。