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qPCR（熒光定量PCR）實(shí)驗(yàn)步驟

2024-03-07 16:32

qPCR實(shí)驗(yàn)，即熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，其步驟主要包括試劑耗材準(zhǔn)備、RNA提取和反轉(zhuǎn)錄、體系配制以及上機(jī)操作。以下是詳細(xì)的步驟說(shuō)明：

試劑耗材準(zhǔn)備：確保實(shí)驗(yàn)所需的八聯(lián)管和槍頭無(wú)酶無(wú)菌，鑷子提前進(jìn)行高壓處理，加樣所用的金屬托架應(yīng)提前放置在冰箱中降溫。

RNA提取和反轉(zhuǎn)錄：這一步需要在低溫條件下進(jìn)行。使用Trizol進(jìn)行RNA提取時(shí)，要注意蛋白質(zhì)層的分離。Mix配置后應(yīng)避免反復(fù)凍融，并注意防止空氣中的小片段核酸污染。RNA提取后應(yīng)盡快進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，不宜久放。

體系配制：在配制體系時(shí)，應(yīng)確保在避光條件下進(jìn)行。每個(gè)樣品應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行孔，以保證數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可用性。如果同一樣本的核酸分裝在多個(gè)小EP管中，建議在配制體系時(shí)盡量將這些核酸轉(zhuǎn)移至一個(gè)管中混勻后再加樣，以保證平行孔間的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。

上機(jī)操作：在上機(jī)前，應(yīng)先對(duì)樣本進(jìn)行離心處理。如果管內(nèi)有氣泡，可以用手指輕彈以去除。加完樣后，樣本不能久置，應(yīng)立即進(jìn)行上機(jī)操作。

除了上述主要步驟外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還需要注意一些細(xì)節(jié)，如引物的設(shè)計(jì)。引物的設(shè)計(jì)應(yīng)遵循一些原則，如擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)在80-150bp之間，堿基應(yīng)隨機(jī)分布，引物長(zhǎng)度應(yīng)在30-45bp之間，且5’端不應(yīng)是G，因?yàn)?/span>G有淬滅作用，可能會(huì)影響定量結(jié)果。

另外，由于實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)的靈敏度高，因此每個(gè)樣品至少需要做3個(gè)平行孔，以防止在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中由于Ct值相差較大或SD值過(guò)大而無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

請(qǐng)注意，實(shí)驗(yàn)的具體步驟可能因?qū)嶒?yàn)?zāi)康摹颖绢愋鸵约八褂玫脑噭┖蛢x器而有所不同。因此，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，建議仔細(xì)閱讀相關(guān)試劑和儀器的說(shuō)明書(shū)，并遵循實(shí)驗(yàn)室的操作規(guī)程。