DdmDE消除質粒的分子機制 Ago是下一個CRISPR嗎

　　原核生物和侵襲性移動遺傳元件(MGEs)之間的進化軍備競賽導致了各種宿主防御系統——如限制性修飾、CRISPR-Cas、Argonaute、CBASS(基于環寡核苷酸的噬菌體信號系統)等等的出現，以抵御侵襲性移動遺傳元件(MGEs)的入侵，在消除入侵的MGE和塑造微生物群落和生態系統中發揮關鍵作用。由于許多分子基因工程工具都起源于原核基因組防御系統，因此了解原核免疫系統不僅對于揭示原核宿主- MGE相互作用的動力學至關重要，而且對于開發應用于生物技術和醫學的分子工具也很有價值——看看如今的CRISPR技術就知道。

　　目前流行的霍亂弧菌菌株含有兩個DNA防御模塊DdmABC和DdmDE，它們合作消除質粒，被認為在第七次大流行的O1 El Tor (7PET)菌株的進化成功中發揮了關鍵作用。來自哥倫比亞大學的研究人員使用低溫電子顯微鏡來確定DdmDE防御質粒的機制基礎。解旋酶-核酸酶DdmD采用自抑制二聚體結構。原核Argonaute蛋白DdmE使用DNA向導靶向質粒DNA。體內突變研究證實了DdmDE復合物的結構，表明DNA與DdmE的結合會引發DdmD二聚體的分解，并將單體DdmD裝載到非靶DNA鏈上。體外研究表明，DdmD沿5′~ 3′方向易位，同時部分降解質粒DNA。這些發現為了解DdmDE系統在質粒消除中的機制提供了重要的見解。文章發表在新一期《Science》上。

　　DdmABC是一種類似lamasus的防御系統，被質粒和噬菌體激活時可導致不產生有感染性病毒的頓挫感染(abortive infection)。 相比之下，DdmDE系統直接作用于小質粒，導致其降解。結構模型表明，DdmE是一種可能識別質粒DNA的原核Argonaute (pAgo)蛋白，而DdmD編碼一種融合蛋白，該融合蛋白包含可以介導質粒降解的解旋酶和核酸酶結構域。這項研究目標是探究DdmDE系統在質粒消除中的機制，為將來改造為基因工具奠定基礎。

　　結果

　　DdmE是DNA引導的DNA靶向Ago

　　pAgo蛋白使用短核酸向導來指導核酸的識別和靶向。作者首先對828個pAgo序列進行了系統發育分析，DdmE的多重序列比對和AlphaFold 2結構建模顯示，在其PIWI結構域中缺乏典型的DEDX催化四聚體，表明DdmE蛋白缺乏內切酶活性，并表明與其他長a pAgo蛋白相比，DdmE不通過內切酶催化的靶核酸切割發揮作用。數據表明，DdmE使用短的(<15 nt) 5 '磷酸化DNA作為tDNA結合的向導。

　　質粒消除需要DdmD的ATP酶和核酸酶活性

　　結構模型預測DdmD含有N端超家族2 (SF2)解旋酶和c端PD-(D/E)XK核酸酶結構域，這表明DdmD可能作為下游效應物，在被DdmE招募和激活后降解質粒DNA。值得注意的是，單獨使用DdmD對ssDNA質粒具有顯著的降解活性，而單獨使用DdmD未觀察到質粒dsDNA的降解，表明DdmD是一種有效的ssDNA核酸酶，需要DdmE激活并招募到其質粒DNA靶點。DdmDE系統的活性包括DNA引導的DdmE靶向和依賴于腺苷三磷酸酶(ATPase)的核酸酶催化的DdmD質粒降解。

　　DdmD受二聚化作用的自動抑制

　　為了深入了解解旋酶-核酸酶DdmD在DdmDE體系中的活性機制，作者利用單粒子冷凍電鏡(cryo-EM)確定了二聚體DdmD的原子結構，表明DdmD是一種PD-(D/E) xk樣核酸酶，其催化活性對于DdmDE防御系統消除質粒至關重要;DdmD以二聚體形式存在于自抑制狀態，這與在沒有DNA引導的DdmE的情況下，DdmD在體外dsDNA質粒上不表現出核酸酶活性的觀察結果一致。

　　DNA引導的tDNA識別和DdmE招募DdmD

　　為了深入了解DdmE的分子結構及其在DdmD激活中的作用，作者重組了一個帶有14-nt 5 '磷酸化DNA向導的DdmD-DdmE復合物和一個帶有錯配非靶鏈的靶dsDNA，以促進d環的形成。DdmDE復合物的結構表明，DdmD同型二聚體在與靶結合的DdmE相互作用時解體，形成1:1的異源二聚體，其中DdmE與gDNA-tDNA雙鏈結合，而DdmD與移位的非靶DNA (ntDNA)鏈結合。研究還表明tDNA結合的DdmE招募DdmD，DdmD-DdmE相互作用是支持其抗質粒活性所必需的關鍵分子決定因素。

　　DdmE介導DdmD裝載到ntDNA鏈上

　　部分討論

　　研究闡明了支持的DdmDE系統的抗質粒活性的分子機制：DdmE屬于催化活性不高的長-a- pAgo蛋白的亞支系，它使用5 ' -磷酸化的DNA向導來靶向DNA。解旋酶核酸酶DdmD最初由于自二聚化而處于自抑制狀態。tDNA與DdmE的結合將DdmD招募到ntDNA鏈上，誘導DdmD二聚體的分解。這反過來又啟動了DdmD通過ATP驅動的ntDNA降解，在5 '到3 '方向上的過程易位。

　　DdmDE的機制與I型CRISPR-Cas系統的分子機制有顯著的相似之處，在I型CRISPR-Cas系統中，RNA引導的效應復合物Cascade將解旋酶-核酸酶融合蛋白Cas3招募到ntDNA鏈上。隨后，Cascade和Cas3保持在復合物中，而DNA被Cas3的解旋酶結構域反復解旋，在DNA靶標中產生短段的ssDNA。

　　鑒于I型CRISPR-Cas系統已被重新用作分子靶向技術，新研究表明，DdmDE可能被利用來通過遞送DNA來消耗細菌菌株，這些DNA將作為自我靶向向導的來源。基于CRISPR-Cas9的類似方法已用于靶向致病的毒力基因，DdmDE可以用來產生自我消除質粒，用于基于重組的基因組工程方法。新研究為DdmDE系統在原核生物基因組防御中的功能提供了基本的機制見解，并可能為利用它們作為新型抗菌或基因工程工具鋪平道路。

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