細胞凍存的操作步驟及注意事項

細胞凍存是細胞生物學實驗中的一項重要技術，它允許研究者在長時間內保存細胞，以備后續實驗使用。以下是細胞凍存的操作步驟及注意事項：

操作步驟

一、細胞準備

細胞收集與計數：

將細胞在培養液中離心，通常是在1000rpm（或250g）左右離心3至5分鐘。

棄去上清液，根據需要重新懸浮細胞。

使用細胞計數器或血細胞計數板來計算細胞密度，確保細胞密度達到凍存要求（如≥90%匯合度或細胞計數在特定范圍內）。

細胞消化：

對于貼壁細胞，用PBS潤洗后，加入胰酶進行消化，消化時間根據細胞類型決定。

消化完成后，加入完全培養基終止消化，并吹打均勻制備成細胞懸液。

二、凍存液制備

配置凍存液：

凍存液通常為含有細胞保護劑（如二甲基亞砜DMSO，通常濃度為10%）的完全培養基。

配置完成后，嚴格避光保存。

三、細胞混合與分裝

細胞混合：

將細胞懸浮液與凍存液混合，使每個凍存管中的細胞數達到推薦范圍（如1~5×10^6個細胞/管）。

快速但輕柔地混合細胞和凍存液，避免DMSO對細胞產生毒性。

分裝與標記：

將混合好的細胞分裝入無菌凍存管中。

封閉并標記凍存管，記錄細胞類型、代數、數量、凍存日期、操作者姓名等信息。

四、冷凍與儲存

冷凍過程：

使用凍存箱或程序冷凍箱緩慢冷凍細胞。常用的方法是每小時降溫-1°C至-80°C，或者將分裝好的凍存管轉入程序降溫盒，再放入-80°C冰箱過夜。

若沒有程序降溫盒，則按室溫→4°C 20分鐘→-20°C 30分鐘→-80°C過夜→液氮保存的順序依次降溫。

長期儲存：

將細胞在-80°C冷凍器中放置足夠時間（如過夜）后，轉移到液氮罐中進行長期儲存。液氮罐的溫度通常在-196°C左右，適合長期保存活細胞。

注意事項

細胞狀態：

應選擇對數期生長、細胞匯合度80%~90%左右的細胞進行凍存操作，確保細胞凍存時狀態**。

凍存前注意切勿消化時間過長、吹打力度過重、離心轉速過大或離心時間過長，以免造成細胞損傷。

凍存液配置：

凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細胞懸液中。

配置完成后，嚴格避光保存。

凍存管選擇：

使用高質量的凍存管，避免在極低溫度下破裂或泄漏。

溫度控制：

控制冷凍速度至關重要。如果冷凍過快，細胞內部可能形成大量小冰晶，破壞細胞結構；如果冷凍過慢，細胞外的大冰晶形成可能導致細胞脫水和損傷。

凍存細胞長期保存應放置于液氮，不建議在-80°C長期保存。

標記與記錄：

適當的標記和記錄是實驗成功的關鍵。確保凍存管上的信息準確無誤，以便后續使用。

定期檢查：

細胞凍存后定期檢查存活率及細胞狀態，確保細胞質量。

綜上所述，細胞凍存需要遵循一系列操作步驟和注意事項，以確保細胞的存活率和后續實驗的成功。