馬血清培養原代神經元細胞的方法

一、實驗前準備

材料收集

新生（通常 1 - 3 天）大鼠或小鼠，幼崽神經系統處于快速發育階段，神經元活力高，更易分離培養成功。

馬血清：需采購優質、無菌、經過檢測無支原體等污染的馬血清，儲存在 -20℃，使用前在 4℃緩慢解凍，避免反復凍融破壞血清中的活性成分。

基礎培養基：如 DMEM（高糖型，為神經元生長提供充足能量）、Neurobasal 培養基等，根據實驗需求選擇合適的基礎培養基，并按需添加谷氨酰胺等營養補充劑維持細胞代謝。

解剖器械：精細鑷子、剪刀（需滅菌處理），用于分離腦組織。

培養器皿：多聚賴氨酸包被的培養皿或蓋玻片，可促進神經元貼壁生長，提前將其放入培養箱預熱。

試劑配制

含馬血清的培養基：將馬血清按一定比例（一般 10% - 20%，可依據前期預實驗優化比例）與基礎培養基混合，加入適量青霉素 - 鏈霉素雙抗（防止細菌污染，終濃度通常 100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素），用 0.22 μm 濾器過濾除菌。

二、原代神經元細胞分離

動物麻醉與消毒

用低溫麻醉法或適宜的吸入性麻醉劑（如異氟烷）將新生動物麻醉，確保深度麻醉后，將其浸泡于 75% 酒精中消毒 3 - 5 分鐘，轉移至超凈工作臺。

腦組織獲取

在無菌條件下，用鑷子、剪刀快速斷頭，取出完整大腦，置于預冷的 Hank's 平衡鹽溶液（HBSS）中，盡量減少組織暴露在空氣中的時間，防止干燥損傷。

細胞解離

去除腦膜、血管等非神經組織后，將腦組織剪成細小碎塊，轉移至含適量胰蛋白酶（一般 0.25%）的離心管中，37℃水浴消化 10 - 15 分鐘，期間輕輕搖晃，使細胞充分解離。消化結束后，加入含血清的培養基終止消化反應。

三、細胞接種與培養

細胞懸液制備

將消化后的組織懸液通過輕柔吹打使其進一步分散，制成單細胞懸液，用 200 目濾網過濾去除未消化的組織塊，收集濾液。

接種

按照一定密度（如 1×10? - 5×10? 個 /mL）將細胞懸液接種到提前預熱、包被好的培養器皿中，輕輕晃動使細胞均勻分布，放入 37℃、5% CO?培養箱培養。

培養條件維持

前 24 小時盡量避免移動培養器皿，減少對剛貼壁細胞的擾動。定期觀察細胞狀態，每 2 - 3 天半量更換含馬血清的新鮮培養基，維持營養供應與環境穩定，注意換液時操作輕柔，防止細胞脫落。

四、細胞鑒定與監測

免疫熒光染色

培養一定時間（如 5 - 7 天）后，細胞貼壁生長并初步分化，可進行免疫熒光染色鑒定神經元特異性標志物（如 MAP2、NeuN 等）。用 4% 多聚甲醛固定細胞，0.1% Triton X - 100 通透處理，依次加入一抗、二抗孵育，最后用 DAPI 染核，在熒光顯微鏡下觀察神經元形態、數量，評估培養效果。

細胞活性監測

定期采用臺盼藍拒染法或 CCK - 8 等細胞活力檢測試劑盒檢測細胞活性，了解細胞增殖、存活情況，若發現細胞大量死亡或生長異常，及時排查培養基、培養環境等因素并調整。

通過以上步驟，利用馬血清培養原代神經元細胞，可為神經科學相關研究，如神經發育機制、神經疾病模型構建等提供基礎的細胞模型支持。但整個過程需嚴格遵守無菌操作規范，精細調控各環節參數，確保培養的神經元細胞質量可靠。